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EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDOS VEGETALES |
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PROTOCOLO DE SHAWN CARLSON |
MATERIALES.
DE USO COMÚN: Agua mineral, sal,
bicarbonato, champú, fruta o verdura, isopropanol (frío), azul de metileno, batidora
o pasapuré, vasos de precipitados grandes (500 ó 1000 ml), centrífuga,
cuchillos, probeta (500 ml), matraces (500 ml), pipeta (5 ml).
PARA CADA GRUPO:
· 1 tubo de
ensayo grande.
· 2 tubos de
ensayo pequeños (para centrífuga).
· 1 pipeta de 10
ml.
· 1 vaso de
precipitados pequeño.
· 1 varilla de
vidrio.
· 1 pipeta
Pateur.
MÉTODO.
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PROCESO |
DETALLES |
FUNCIÓN |
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Preparación del tampón (común para todos los grupos). (Se
prepará con anterioridad) |
240
ml agua mineral + 3 g de sal + 10 g de bicarbonato + 10 ml de champú. Enfríar
a 0º C. |
El
tampón contiene una concentración
muy alta de iones que permite romper las membranas de las células y del
núcleo |
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Preparción del material
biológico. Trituración
del material biológico, mejor en frío. |
Se
trocean las verduras, se les añade un poco de agua y a continuación se
trituran utilizando una batidora. Para triturarlo se dan tres pulsos de 10
segundos cada uno. Si
es posible hacerlo en frío. |
Al
triturar las verduras lo que
hacemos es romper las membranas de muchas células con lo que liberamos su
contenido (orgánulos, núcleos, proteínas, ADN, ARN ...) |
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Mezcla del “puré” con el tampón
frío. |
Se
cogen 5 ml del triturado y se depositan en el tubo de ensayo grande. A
continuación se le añaden 10 ml del tampón frío. Se
agita VIGOROSAMENTE durante 2 minutos. |
Al
mezclar el “puré” con el tampón
conseguimos que se rompan las membranas de las células y de los núcleos sin
que se estropee el ADN que queremos obtener. Además
el detergente que lleva el tampón
ayuda a terminar de romper las membranas de los núcleos celulares en los que
se encuentra el ADN y además elimina proteínas que se encuentran protegiendo
el ADN. |
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Centrifugación 5’. |
El
contenido del tubo de ensayo se separa en los dos tubos de ensayo pequeños,
de manera que los dos tengan la misma masa. A
continuación estos tubos se ponen en la centrífuga durante 5 min. |
Con
la centrifugación se separan los
materiales más grandes, como células enteras, membranas, grandes orgánulos
(se quedan en el fondo del tubo) de los materiales más pequeños como
proteínas, pequeños orgánulos, ADN y ARN (que quedan en el líquido sobrenadante). |
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Recoger el sobrenadante. |
Tras
la centrifugación se recoge el sobrenadante (con cuidado de no coger el
precipitado) de cada uno de los tubos de ensayo; para ello nos ayudamos de
una pipeta Pasteur. Este sobrenadante lo pondremos en el vaso de precipitados
pequeño. |
Recoger
la porción en la que se encuentra el ADN (además de otras sustancias como
ARN, proteínas y pequeños orgánulos). |
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Añadir 10 ml de isopropanol
frío. |
Se
añaden en el vaso de precipitados sobre nuestra muestra con mucho cuidado: para ello se va dejando
caer el isopropanol sobre las paredes del vaso de precipitados. |
Hace
que el ADN precipite en la interfase propanol-agua, mientras que el resto de
materiales se quedan en el “puré”. |
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PROCESO |
DETALLES |
FUNCIÓN |
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Recoger el ADN con una varilla
de vidrio. |
Tras
añadir el isopropanol en nuestra muestra han quedado dos fases, una superior
(contiene el isopropanol) y otra inferior. Se
introduce la varilla de vidrio en la interfase entre el isopropanol y el
resto de la muestra y se va moviendo la varilla con cuidado de uno a otro
lado durante 1 min. Entonces se saca la varilla y en ella tenemos pegado el
ADN |
Recoger
el ADN (también nos llevamos el ARN). En
los laboratorios de biología molecular se añadiría una enzima que destruye el
ARN de modo que sólo obtuviésemos ADN. |
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Añadir una gota de azul de
metileno al tubo de ensayo. |
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El
método que hemos utilizado para extraer al ADN no es todo lo eficiente que quisiéramos,
con lo que en la muestra todavía queda ADN sin extraer. Al añadir el azul de
metileno, en la interfase, se teñirán las fibras de ADN que no hemos
conseguido extraer. |
NOTA: A pesar de que no es mucha la eficiencia del método que
hemos usado es posible utilizar el ADN obtenido para realizar otros
experimentos.
BIBLIOGRAFÍA.
CARLSON,
S.
(1998). Deshilando el tejido de la vida. Investigación y Ciencia. 266, 84-85.
Para más información: